01. 싱글셀 RNA 시퀀싱이란

싱글셀 RNA 시퀀싱(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)은 한 조직(tissue) 샘플에 섞여 있는 세포들의 RNA를 세포별로 구분해 측정하는 실험 방법입니다. 세포나 핵의 현탁액을 입력받아 각 세포에서 검출된 유전자별 RNA 분자 수를 담은 cell × gene 행렬을 만듭니다.

이 수업의 질문: 섞여 있던 세포가 어떻게 표의 서로 다른 행으로 바뀌는가?

결과부터 보면 세포 하나가 표의 한 행이다

종양 조직 샘플에서 세포 네 개를 포획했다고 가정해 봅시다. 아래 값은 설명을 위한 가상 RNA 분자 수입니다.

cell	EPCAM	CD3D	COL1A1
cell_1	18	0	0
cell_2	15	0	1
cell_3	0	21	0
cell_4	1	0	16

cell_1과 cell_2는 EPCAM, cell_3은 CD3D, cell_4는 COL1A1 RNA가 많이 검출됐습니다. 연구자는 이런 발현 조합을 이용해 상피세포, T세포, 섬유아세포 같은 세포 집단을 찾습니다.

여기서 한 행은 원래 샘플에 있던 세포의 완전한 복사본이 아닙니다. 실험 장치에 들어온 RNA 일부가 DNA 사본인 cDNA로 바뀌고, 시퀀서가 읽은 짧은 서열 조각인 read로 표본 추출된 결과입니다. 값이 0이어도 그 세포에 RNA가 전혀 없었다기보다 검출되지 않았을 수 있습니다.

대표적인 미세 방울 실험은 네 단계로 진행된다

1. 조직 샘플을 세포 또는 핵으로 분리한다

고형 조직은 효소와 물리적 처리를 거쳐 세포 현탁액으로 만듭니다. 냉동 조직 샘플처럼 온전한 세포를 얻기 어려우면 핵만 분리하는 single-nucleus RNA-seq를 사용할 수 있습니다.

2. 세포마다 고유한 표지를 붙인다

Droplet 방식에서는 보통 세포 하나와 고유 서열 표지(barcode)가 달린 bead 하나를 미세한 방울에 함께 넣습니다. 세포의 mRNA를 DNA 사본인 cDNA로 복사할 때 cell barcode와 UMI(unique molecular identifier, 고유 분자 식별자)가 붙습니다.

cell barcode: 이 cDNA가 어느 세포에서 왔는지 표시
UMI: 원래 RNA 분자 하나를 구분해 DNA 사본을 늘리는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에서 생긴 복제본을 하나로 접는 표지

3. cDNA를 한데 모아 시퀀싱한다

Barcode를 붙인 뒤에는 여러 세포의 cDNA를 섞어 같은 시퀀서에서 읽을 수 있습니다. 각 read에는 세포 출처를 알려 주는 barcode와 유전자에 정렬할 cDNA 서열이 함께 연결됩니다.

4. read를 다시 세포별 count로 모은다

분석 소프트웨어는 cDNA 서열을 유전자에 배정하고, 같은 cell barcode끼리 read를 모으며, UMI를 이용해 PCR 중복을 제거합니다. 최종 출력은 barcode마다 유전자별 count를 적은 행렬이며, 대부분 값이 0이라 희소 행렬이라고 부릅니다.

이름에 들어 있는 세 단어를 구분해 읽는다

단어	뜻	흔한 오해
single-cell	세포 출처를 barcode로 구분	세포마다 시퀀서를 따로 돌린다는 뜻은 아님
RNA	그 시점에 검출된 전사체를 측정	DNA 변이나 단백질을 직접 측정하는 것은 아님
sequencing	cDNA 조각을 read로 표본 추출	세포 안의 모든 RNA를 빠짐없이 읽는 것은 아님

따라서 scRNA-seq는 세포의 전체 모습을 그대로 촬영하는 기술이 아닙니다. 포획 시점의 RNA 일부를 읽어 어떤 세포 집단이 있고, 각 집단이 어떤 유전자 프로그램을 보이는지 추정하는 기술입니다.

무엇을 답할 수 있는가

조직 샘플에 어떤 세포 집단이 섞여 있는가?
드문 세포 집단이 존재하는가?
같은 세포 종류 안에서 활성화·증식·스트레스 상태가 다른가?
질환군과 대조군에서 특정 세포 종류의 구성이나 발현이 달라지는가?

반면 세포가 원래 조직의 어느 위치에 있었는지, RNA 변화가 단백질 변화로 이어졌는지, 관찰된 차이가 원인인지 결과인지는 count matrix만으로 알 수 없습니다. 공간 전사체, 단백질 측정, 시간 정보나 기능 실험이 별도로 필요합니다.

전체 분석 흐름에서의 위치

시퀀싱할 cDNA 조각의 모음을 library라고 합니다. 시퀀서 출력은 각 read의 서열과 품질 점수를 담은 FASTQ 파일입니다.

구간	입력	출력
실험	조직 샘플, 세포 또는 핵 현탁액	barcode가 붙은 cDNA library
시퀀싱	cDNA library	FASTQ read
1차 분석	FASTQ와 참조 유전체	cell × gene count matrix
2차 분석	count matrix와 샘플 정보	품질 관리, 세포 군집, 세포 종류와 조건 비교

정리

싱글셀 RNA 시퀀싱은 섞여 있던 세포의 RNA에 세포별 표지를 붙이고 함께 시퀀싱한 뒤, read를 다시 세포별 유전자 count로 모으는 방법입니다. 핵심 결과물은 세포가 행, 유전자가 열인 희소 행렬이며, 이 행렬로 세포 구성과 세포별 상태 차이를 분석합니다.

다음 조직(tissue) 평균에서 세포별 발현으로에서는 같은 조직 샘플을 bulk와 싱글셀로 측정했을 때 어떤 정보가 남고 사라지는지 비교합니다.

출처

초기 단일세포 전사체 측정: Tang et al., Nature Methods (2009)
droplet 기반 대량 단일세포 전사체 측정: Zheng et al., Nature Communications (2017)
싱글셀 전사체 분석 모범 사례: Heumos et al., Nature Reviews Genetics (2023)