02. 조직(tissue) 평균에서 세포별 발현으로

여러 세포의 RNA를 합쳐 측정하는 벌크 RNA 시퀀싱(bulk RNA sequencing, bulk RNA-seq)과 세포별 출처를 보존하는 싱글셀 RNA 시퀀싱(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)의 가장 큰 차이는 장비가 아니라 표의 행이 무엇인가입니다. 벌크 표의 열 하나는 여러 세포가 섞인 샘플 하나이고, 싱글셀 표의 행 하나는 포획된 세포 하나입니다.

이 수업의 질문: 여러 세포가 섞인 신호를 세포별 행렬로 바꾸면 무엇을 새로 볼 수 있는가?

같은 조직 샘플에서 세포 여섯 개를 얻었다고 가정해 봅시다. 아래 값은 설명을 위해 만든 가상의 검출 RNA 분자 수입니다. 실제 미세 방울 방식 실험에서는 원래 RNA 분자마다 붙이는 고유 표지인 고유 분자 식별자(unique molecular identifier, UMI)를 이용해 이 수를 근사합니다.

cell	EPCAM	CD3D	FAP
cell_1	12	0	0
cell_2	10	0	0
cell_3	1	9	0
cell_4	0	8	0
cell_5	0	0	14
cell_6	1	0	12

행을 유지하면 EPCAM이 높은 세포, CD3D가 높은 세포, FAP가 높은 세포를 구분할 수 있습니다. 모두 더해 벌크 값 하나로 만들면 FAP RNA가 샘플에 있다는 사실은 남지만, 그것이 어느 세포에서 나왔는지는 사라집니다.

EPCAM, CD3D, FAP는 서로 다른 세포 집단에서 높게 나타날 수 있는 예시 유전자입니다. 여기서는 이름을 외우기보다 같은 샘플 안에서 세포별 값이 다르다는 점만 보면 됩니다.

평균 하나로는 서로 다른 구성을 구분할 수 없다

서비스 평균 응답 시간이 200ms여도 모든 요청이 200ms일 수 있고, 대부분은 100ms인데 소수 요청만 2초일 수도 있습니다. 평균만 저장한 뒤에는 두 장면을 복원할 수 없습니다.

여러 세포가 섞인 샘플도 같은 문제를 가집니다. 유전자 발현량이 올라간 이유는 적어도 두 가지일 수 있습니다.

• 같은 세포 종류가 유전자를 더 강하게 발현했다.
• 그 유전자를 원래 많이 발현하는 세포 종류의 비율이 늘었다.

싱글셀 RNA-seq는 포획한 세포별 행을 보존하므로 세포 구성 변화와 같은 세포 종류 안의 상태 변화를 나눠 질문할 수 있습니다. 이것이 벌크 데이터에서 작은 세포 집단의 신호가 묻힐 때 싱글셀을 선택하는 주된 이유입니다.

대조가 되는 벌크 유전자×샘플 행렬은 GSE251845 DEG 실습의 입력 표에서 직접 확인할 수 있습니다. 그 표의 한 열에는 여러 세포의 신호가 합쳐져 있습니다.

벌크에서 세포 구성을 추정하는 것과 직접 측정은 다르다

xCell은 벌크 발현표에서 세포 유형의 특징적인 유전자 묶음이 얼마나 강한지 추정하는 도구입니다. 이런 특징 유전자 묶음을 signature라고 하고, 혼합된 신호에서 세포 구성을 추정하는 작업을 deconvolution이라고 합니다. 많은 조직 샘플을 이미 측정했다면 새 실험 없이 세포 구성의 단서를 얻을 수 있다는 장점이 있습니다.

그러나 xCell 출력은 세포 한 개씩 센 표가 아니라 세포 유형별 enrichment score입니다. 이 점수는 해당 signature가 샘플에서 상대적으로 얼마나 강한지를 나타내며 세포 비율이 아닙니다. xCell 논문도 서로 다른 세포 유형의 점수를 직접 비교하거나 실제 비율로 해석할 수 없다고 설명합니다.

방법	입력의 관측 단위	출력	직접 말할 수 있는 것
벌크 RNA-seq	여러 세포가 섞인 샘플	유전자 × 샘플 발현량	샘플 전체의 혼합 발현 신호
xCell	벌크 발현량	샘플별 세포 유형 enrichment score	특정 signature가 상대적으로 강한지
싱글셀 RNA-seq	포획된 세포	세포 × 유전자 count	포획된 세포 사이의 발현 차이

세포별 행이 곧 원래 샘플 전체는 아니다

싱글셀 행렬의 행은 원래 샘플에 있던 모든 세포가 아니라 분리 과정에서 살아남고 포획되고 RNA가 검출된 세포입니다. 조직을 효소로 풀 때 약한 세포가 더 많이 깨지거나, 크고 끈적한 세포가 장비에 덜 들어갈 수 있습니다.

따라서 행렬에서 T세포가 30%라고 해서 원래 조직의 부피나 전체 세포의 정확히 30%가 T세포였다고 바로 결론 내릴 수는 없습니다. 표본 채취, 조직 분리, 포획 효율과 품질 관리(QC) 기준을 함께 확인해야 합니다.

공간 정보도 사라집니다. 세포를 현탁액으로 풀면 어느 세포가 어느 세포 옆에 있었는지 알 수 없습니다. 위치가 질문의 핵심이라면 공간 전사체나 조직 영상이 추가로 필요합니다.

이 시리즈가 다루는 출력

앞으로 따라갈 핵심 자료형은 다음과 같습니다.

단계	출력
세포 분리와 주소 표지	세포 출처와 원래 RNA 분자 표지가 붙은 RNA의 DNA 사본(cDNA)
시퀀싱과 1차 처리	세포 주소별 유전자 count matrix
품질 관리	분석에 사용할 cell × gene count matrix
군집과 주석	비슷한 세포 집단 번호와 세포 종류 이름
조건 비교	세포 유형별 표본 단위 발현량과 구성비

정리

벌크 RNA-seq는 샘플 전체의 혼합 발현 신호를 측정하고, 싱글셀 RNA-seq는 포획된 세포별 발현 행을 보존합니다. 덕분에 소수 세포와 세포별 상태 차이를 볼 수 있지만, 포획된 세포 비율을 원래 조직의 정확한 구성으로 간주해서는 안 됩니다.

다음 세포와 RNA 분자에 주소 붙이기에서는 수천 세포의 RNA를 한꺼번에 시퀀싱하고도 시퀀서가 읽은 짧은 서열 조각인 read의 세포와 원래 분자를 구분하는 방법을 살펴봅니다.

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출처

• droplet 기반 대량 단일세포 전사체 측정: Zheng et al., Nature Communications (2017)
• xCell 출력과 해석 한계: Aran et al., Genome Biology (2017)
• 조직 분리와 보존 과정의 세포 구성 편향: Denisenko et al., Genome Biology (2020)