05. raw count를 비교 가능한 값으로 바꾸기

정렬된 read를 유전자마다 세면 raw count가 나옵니다. 하지만 이 숫자에는 실제 발현량뿐 아니라 유전자 길이와 시퀀싱 깊이가 섞여 있습니다. 위젯을 직접 움직이며 두 영향을 분리하고, 비교 목적에 맞는 값으로 바꾸는 과정을 따라갑니다.

이 수업의 질문: 같은 발현량인데도 달라지는 raw count를 어떻게 비교 가능한 값으로 바꾸는가?

정렬까지가 각 이벤트에 gene_id를 붙이는 단계였다면, 정량은 그 이벤트를 GROUP BY gene_id로 집계하는 단계입니다. raw count는 정확한 집계값이지만, 요청 수가 실행 시간과 서버 수에 함께 좌우되는 것처럼 유전자 발현 외의 조건에도 좌우됩니다.

raw_count = alignments.groupby("gene_id").size()
rpk = raw_count / gene_length_kb
tpm = rpk / rpk.sum() * 1_000_000

이 의사코드에서 raw_count는 관측값, gene_length_kb는 유전자별 고정 메타데이터, rpk.sum()은 샘플별 스케일입니다. 어떤 분모를 언제 적용했는지가 지표의 의미를 결정합니다.

한 줄 요약: raw count는 유전자 길이와 시퀀싱 뎁스 두 가지에 오염돼 있어 그대로 비교할 수 없습니다. TPM은 길이 → 뎁스 순으로 보정해, 모든 샘플의 발현량 합계를 정확히 1,000,000으로 고정합니다. 그래서 TPM 값 하나는 “백만 개 전사체 중 이 유전자 몇 개”라는 동일한 잣대가 됩니다.

1. raw count는 두 가지에 휘둘린다

정렬된 BAM에서 유전자마다 붙은 read를 세면 정수 하나(raw count)가 나옵니다. 문제는 이 숫자가 “그 유전자가 얼마나 발현됐나” 를 곧이곧대로 말해 주지 않는다는 점입니다.

데이터 구조로는 다음과 같은 변환입니다.

정렬 레코드	집계 키	집계 결과
read 1 → `GENE_A`	`GENE_A`
read 2 → `GENE_A`	`GENE_A`	`GENE_A: 2`
read 3 → `GENE_B`	`GENE_B`	`GENE_B: 1`

이 숫자를 바로 비교하려면 모든 유전자가 같은 길이이고 모든 샘플을 같은 깊이로 읽었다는 조건이 필요합니다. 실제 데이터는 두 조건을 만족하지 않습니다.

함정 ①: 유전자 길이

mRNA를 잘게 조각내어 시퀀싱하므로, 같은 수의 mRNA 분자라도 긴 유전자에서 조각(fragment)이 더 많이 나옵니다. 즉 read 수는 발현량이 아니라 발현량 × 길이에 비례합니다. 아래 애니메이션에서 유전자 → 전사(mRNA) → 조각내기 → 정렬을 단계별로 따라가 보세요. 발현량(mRNA 3개)을 똑같이 맞췄는데도, 긴 A는 read가 18개·짧은 B는 6개로 벌어집니다. 마지막 단계에서 길이로 나누면 둘이 같아집니다.

이 ”÷ 유전자 길이”가 정규화의 첫 단계이고, 그 결과가 RPK(reads per kilobase) 입니다. 길이가 사라지면 비로소 한 샘플 안에서 유전자끼리 비교할 수 있습니다.

함정 ②: 시퀀싱 뎁스

같은 샘플을 더 깊게 시퀀싱하면 모든 유전자의 count가 그만큼 커집니다. 발현이 변한 게 아니라 더 많이 읽었을 뿐입니다. 그래서 서로 다른 샘플을 비교하려면, 각 유전자 count를 그 샘플의 전체 read 수(뎁스) 로 나눠 스케일을 맞춰야 합니다. 아래에서 같은 조직(tissue)을 얕게·깊게(3배) 시퀀싱하는 과정을 따라가 보세요: raw count는 전부 3배로 벌어지지만, 전체 read로 나누면 두 샘플이 다시 같아집니다.

정리하면 정규화가 풀어야 할 숙제는 둘입니다: 길이(유전자 간 비교를 막음)와 뎁스(샘플 간 비교를 막음).

2. 한 걸음씩 보정하기: RPK → RPKM/FPKM → TPM

두 보정을 어떤 순서로 적용하느냐가 지표를 가릅니다.

지표	보정	계산
CPM (counts per million)	뎁스만	count ÷ (전체 read/10⁶)
RPK (reads per kilobase)	길이만	count ÷ 길이(kb)
RPKM / FPKM	뎁스 → 길이	count ÷ (전체 read/10⁶) ÷ 길이(kb)
TPM	길이 → 뎁스	(count ÷ 길이) 를 구한 뒤, 그 합으로 다시 나눔 ×10⁶

RPKM과 FPKM은 사실상 같은 값입니다. read를 세면 RPKM, fragment(paired-end에서 read 쌍 하나 = fragment 하나)를 세면 FPKM일 뿐입니다.
RPKM/FPKM은 뎁스로 먼저 나눈 뒤 길이로 나눕니다. 그래서 샘플마다 합계가 제각각이 됩니다.
TPM은 순서를 뒤집습니다. 먼저 길이로 나눠 RPK를 구하고(유전자별 “농도”), 그다음 그 RPK들의 합으로 나눠 백만을 곱합니다. 이 마지막 단계가 결정적입니다: 합으로 나누므로 결과의 총합이 항상 10⁶ 이 됩니다.

각 약어의 정확한 정의, 기호와 수식은 RNA-seq 발현량 정규화 지표에 분리해 두었습니다. 여기서는 TPM이 풀려는 두 문제와 계산 결과의 성질에만 집중합니다.

3. TPM 2단계 계산: 직접 해보기

TPM의 실제 계산은 딱 두 단계입니다.

Step 1. 유전자별 count ÷ 길이(kb) = RPK: 긴 유전자일수록 read가 많은 편향 제거

Step 2. 각 RPK ÷ (그 샘플의 RPK 총합) × 10⁶ = TPM: 뎁스 보정 + 총합을 100만으로 고정

아래 계산기에서 지표(Raw/RPKM/TPM) 를 바꿔 가며, 특히 맨 아래 열 합계 Σ 가 어떻게 달라지는지 보세요. Sample A는 네 유전자가 동일하게 발현된 기준 샘플이고, Sample B는 시나리오 버튼·슬라이더로 바꿀 수 있습니다.

4. 왜 TPM이 샘플 간 비교에 유리한가

위 계산기에서 지표를 TPM으로 두고 Sample B 시나리오를 눌러 보면 한 가지가 드러납니다:

어떤 시나리오에서도 Σ TPM = 1,000,000. 뎁스를 ×3으로 늘려도, 한 유전자를 폭증시켜도 총합은 늘 100만입니다.

이게 핵심입니다. 총합이 고정돼 있으니 TPM 값 하나가 “전체 전사체 100만 개 중 이 유전자의 몫” 이라는 절대적이지 않지만 일관된 잣대가 됩니다. 두 샘플의 TPM을 나란히 놓고 바로 비교할 수 있는 이유죠.

반면 RPKM은 시나리오를 바꿀 때마다 Σ RPKM이 출렁입니다. 합계가 샘플마다 다르면, 같은 RPKM 숫자라도 두 샘플에서 차지하는 비율이 달라 나란히 비교할 때 미묘하게 어긋납니다. 이것이 오늘날 발현량 비교에 FPKM보다 TPM을 권장하는 이유입니다.

5. 주의: TPM도 만능은 아니다

TPM이 모든 비교를 해결해 주지는 않습니다. 위 위젯에서 이미 힌트가 나왔습니다.

TPM은 절대량이 아니라 비율입니다. 총합이 100만으로 고정돼 있어, 한 유전자가 폭증하면(계산기의 ‘G4 폭증’) 다른 유전자들의 TPM이 실제로는 안 변했는데도 떨어져 보입니다. 파이를 나눠 갖기 때문입니다(compositional effect).
엄밀한 차등발현(DEG) 분석에는 raw count를 씁니다. DESeq2 같은 도구는 count의 변동과 시퀀싱 깊이를 모델 안에서 직접 다루므로 raw count를 요구합니다.
정리하면 쓰임이 갈립니다: 한 샘플을 레퍼런스 분포와 견주거나(아웃라이어 탐색), 유전자 간·샘플 간 발현을 눈으로 비교할 때는 TPM. 여러 샘플의 통계적 차등발현을 검정할 때는 raw count + 전용 툴.

차등발현이 반복 샘플의 변동을 다루는 원리는 여러 샘플의 차등발현 검정에서, 음이항분포와 다중검정은 통계적 검정과 다중검정에서 설명합니다.

같은 정렬 결과에서 RSEM으로 TPM을 만드는 단계와 featureCounts로 raw count를 만드는 단계를 나란히 실행하면 두 지표의 쓰임 차이를 파일 수준에서 확인할 수 있습니다.

정리: 지표 한눈 비교

지표	길이 보정	뎁스 보정	샘플 내 유전자 비교	샘플 간 비교	주 쓰임
raw count	✗	✗	✗	✗	DEG 도구(DESeq2/edgeR) 입력
CPM	✗	✓	✗	△	대략적 뎁스 보정
RPK	✓	✗	✓	✗	(중간 단계)
RPKM/FPKM	✓	✓	✓	△ (합이 달라짐)	과거 표준, 지금은 지양
TPM	✓	✓	✓	✓ (Σ=10⁶)	발현량 비교·레퍼런스 대조

다음 유전자가 함께 만드는 작업 흐름에서는 여러 유전자가 연결되어 하나의 세포 반응을 만드는 방식을 배웁니다. 이렇게 만든 TPM 행렬의 실제 활용은 한 샘플에서 아웃라이어 유전자를 찾는 과정에서 이어집니다.

출처

Wagner et al., “Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples”, Theory in Biosciences 2012: DOI
Lior Pachter, “Models for transcript quantification from RNA-Seq” (TPM 정의): arXiv:1104.3889
RSEM · featureCounts (Subread) · DESeq2