# 02. 조직(tissue) 평균에서 세포별 발현으로

> 여러 세포를 합친 유전자×샘플 평균과 세포별 유전자 행렬을 비교하고, 세포별 측정으로 새로 답할 수 있는 질문과 남는 한계를 설명한다.

여러 세포의 RNA를 합쳐 측정하는 **벌크 RNA 시퀀싱**(bulk RNA sequencing, bulk RNA-seq)과 세포별 출처를 보존하는 **싱글셀 RNA 시퀀싱**(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)의 가장 큰 차이는 장비가 아니라 **표의 행이 무엇인가**입니다. 벌크 표의 열 하나는 여러 세포가 섞인 샘플 하나이고, 싱글셀 표의 행 하나는 포획된 세포 하나입니다.

> **이 수업의 질문**: 여러 세포가 섞인 신호를 세포별 행렬로 바꾸면 무엇을 새로 볼 수 있는가?

같은 조직 샘플에서 세포 여섯 개를 얻었다고 가정해 봅시다. 아래 값은 설명을 위해 만든 가상의 검출 RNA 분자 수입니다. 실제 미세 방울 방식 실험에서는 원래 RNA 분자마다 붙이는 고유 표지인 **고유 분자 식별자**(unique molecular identifier, UMI)를 이용해 이 수를 근사합니다.

| cell | EPCAM | CD3D | FAP |
| --- | ---: | ---: | ---: |
| cell_1 | 12 | 0 | 0 |
| cell_2 | 10 | 0 | 0 |
| cell_3 | 1 | 9 | 0 |
| cell_4 | 0 | 8 | 0 |
| cell_5 | 0 | 0 | 14 |
| cell_6 | 1 | 0 | 12 |

행을 유지하면 `EPCAM`이 높은 세포, `CD3D`가 높은 세포, `FAP`가 높은 세포를 구분할 수 있습니다. 모두 더해 벌크 값 하나로 만들면 `FAP` RNA가 샘플에 있다는 사실은 남지만, 그것이 어느 세포에서 나왔는지는 사라집니다.

`EPCAM`, `CD3D`, `FAP`는 서로 다른 세포 집단에서 높게 나타날 수 있는 예시 유전자입니다. 여기서는 이름을 외우기보다 같은 샘플 안에서 세포별 값이 다르다는 점만 보면 됩니다.

## 평균 하나로는 서로 다른 구성을 구분할 수 없다

서비스 평균 응답 시간이 200ms여도 모든 요청이 200ms일 수 있고, 대부분은 100ms인데 소수 요청만 2초일 수도 있습니다. 평균만 저장한 뒤에는 두 장면을 복원할 수 없습니다.

여러 세포가 섞인 샘플도 같은 문제를 가집니다. 유전자 발현량이 올라간 이유는 적어도 두 가지일 수 있습니다.

- 같은 세포 종류가 유전자를 더 강하게 발현했다.
- 그 유전자를 원래 많이 발현하는 세포 종류의 비율이 늘었다.



싱글셀 RNA-seq는 포획한 세포별 행을 보존하므로 **세포 구성 변화**와 **같은 세포 종류 안의 상태 변화**를 나눠 질문할 수 있습니다. 이것이 벌크 데이터에서 작은 세포 집단의 신호가 묻힐 때 싱글셀을 선택하는 주된 이유입니다.

대조가 되는 벌크 유전자×샘플 행렬은 [GSE251845 DEG 실습의 입력 표](/practice/colorectal-deg-gse251845/#분석할-데이터는-어떻게-생겼나)에서 직접 확인할 수 있습니다. 그 표의 한 열에는 여러 세포의 신호가 합쳐져 있습니다.

## 벌크에서 세포 구성을 추정하는 것과 직접 측정은 다르다

xCell은 벌크 발현표에서 세포 유형의 특징적인 유전자 묶음이 얼마나 강한지 추정하는 도구입니다. 이런 특징 유전자 묶음을 **signature**라고 하고, 혼합된 신호에서 세포 구성을 추정하는 작업을 **deconvolution**이라고 합니다. 많은 조직 샘플을 이미 측정했다면 새 실험 없이 세포 구성의 단서를 얻을 수 있다는 장점이 있습니다.

그러나 xCell 출력은 세포 한 개씩 센 표가 아니라 **세포 유형별 enrichment score**입니다. 이 점수는 해당 signature가 샘플에서 상대적으로 얼마나 강한지를 나타내며 세포 비율이 아닙니다. xCell 논문도 서로 다른 세포 유형의 점수를 직접 비교하거나 실제 비율로 해석할 수 없다고 설명합니다.

| 방법 | 입력의 관측 단위 | 출력 | 직접 말할 수 있는 것 |
| --- | --- | --- | --- |
| 벌크 RNA-seq | 여러 세포가 섞인 샘플 | 유전자 × 샘플 발현량 | 샘플 전체의 혼합 발현 신호 |
| xCell | 벌크 발현량 | 샘플별 세포 유형 enrichment score | 특정 signature가 상대적으로 강한지 |
| 싱글셀 RNA-seq | 포획된 세포 | 세포 × 유전자 count | 포획된 세포 사이의 발현 차이 |

## 세포별 행이 곧 원래 샘플 전체는 아니다

싱글셀 행렬의 행은 원래 샘플에 있던 모든 세포가 아니라 **분리 과정에서 살아남고 포획되고 RNA가 검출된 세포**입니다. 조직을 효소로 풀 때 약한 세포가 더 많이 깨지거나, 크고 끈적한 세포가 장비에 덜 들어갈 수 있습니다.

따라서 행렬에서 T세포가 30%라고 해서 원래 조직의 부피나 전체 세포의 정확히 30%가 T세포였다고 바로 결론 내릴 수는 없습니다. 표본 채취, 조직 분리, 포획 효율과 품질 관리(QC) 기준을 함께 확인해야 합니다.

공간 정보도 사라집니다. 세포를 현탁액으로 풀면 어느 세포가 어느 세포 옆에 있었는지 알 수 없습니다. 위치가 질문의 핵심이라면 공간 전사체나 조직 영상이 추가로 필요합니다.

## 이 시리즈가 다루는 출력

앞으로 따라갈 핵심 자료형은 다음과 같습니다.

| 단계 | 출력 |
| --- | --- |
| 세포 분리와 주소 표지 | 세포 출처와 원래 RNA 분자 표지가 붙은 RNA의 DNA 사본(cDNA) |
| 시퀀싱과 1차 처리 | 세포 주소별 유전자 count matrix |
| 품질 관리 | 분석에 사용할 cell × gene count matrix |
| 군집과 주석 | 비슷한 세포 집단 번호와 세포 종류 이름 |
| 조건 비교 | 세포 유형별 표본 단위 발현량과 구성비 |

## 정리

벌크 RNA-seq는 샘플 전체의 혼합 발현 신호를 측정하고, 싱글셀 RNA-seq는 포획된 세포별 발현 행을 보존합니다. 덕분에 소수 세포와 세포별 상태 차이를 볼 수 있지만, 포획된 세포 비율을 원래 조직의 정확한 구성으로 간주해서는 안 됩니다.

다음 [세포와 RNA 분자에 주소 붙이기](/lessons/cell-barcode-umi/)에서는 수천 세포의 RNA를 한꺼번에 시퀀싱하고도 시퀀서가 읽은 짧은 서열 조각인 read의 세포와 원래 분자를 구분하는 방법을 살펴봅니다.

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### 출처

- droplet 기반 대량 단일세포 전사체 측정: [Zheng et al., *Nature Communications* (2017)](https://www.nature.com/articles/ncomms14049)
- xCell 출력과 해석 한계: [Aran et al., *Genome Biology* (2017)](https://link.springer.com/article/10.1186/s13059-017-1349-1)
- 조직 분리와 보존 과정의 세포 구성 편향: [Denisenko et al., *Genome Biology* (2020)](https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7265231/)