# 05. 빈 방울과 저품질 세포 걸러내기

> 세포가 든 방울과 빈 방울을 나누고, 세포별 RNA 분자 수·검출 유전자 수·미토콘드리아 유전자 비율을 함께 확인하는 싱글셀 품질 관리 원리.

싱글셀 품질 관리(quality control, QC)는 숫자가 작은 행을 지우는 작업이 아닙니다. 먼저 세포 후보의 주소인 **cell barcode가 실제 세포를 나타내는지**, 그다음 **그 세포의 발현표가 분석할 만한 상태인지**를 따로 판단합니다.

> **이 수업의 질문**: 어떤 barcode를 실제로 포획된 한 세포의 발현표로 사용할 수 있는가?

여기서 **UMI count**는 고유 분자 식별자(unique molecular identifier, UMI)를 이용해 DNA 사본을 늘리는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)의 중복을 접은 뒤 남은 원래 RNA 분자 수입니다. **Mitochondrial fraction**은 전체 count 중 미토콘드리아 유전자에 배정된 비율입니다. **Empty droplet**은 세포가 들어가지 않은 방울, **doublet**은 한 방울에 세포 두 개가 들어간 경우입니다. **Ambient RNA**는 깨진 세포에서 나와 용액에 떠다니는 RNA입니다.

## barcode 수준과 세포 수준 검사를 나눈다

| 검사 단위 | 질문 | 대표 신호 |
| --- | --- | --- |
| barcode | 세포가 든 방울인가? | 총 UMI와 빈 방울 RNA 패턴과의 차이 |
| cell | 온전한 한 세포의 발현표인가? | 검출 gene 수, mitochondrial fraction, doublet 가능성 |
| sample | 실험 전체가 정상인가? | 포획 세포 수, 세포당 검출 gene 수, 유효 barcode 비율 |

세 수준을 섞으면 원인을 잘못 찾기 쉽습니다. 예를 들어 세포 수가 적은 run과, 세포 수는 충분하지만 각 세포의 검출 유전자 수가 낮은 run은 다른 문제입니다.

## 1. empty droplet을 실제 세포와 나눈다

세포를 담지 못한 방울에도 용액에 떠다니는 RNA가 들어갈 수 있습니다. 이 barcode는 UMI count가 0이 아니지만 어느 한 세포의 전사체를 나타내지 않습니다.

Barcode별 총 UMI를 큰 순서대로 그린 곡선을 **barcode-rank plot**이라고 합니다. 실제 세포가 많은 앞부분은 UMI가 높고, 빈 방울 barcode가 이어지는 뒷부분은 낮습니다. 그러나 경계가 항상 깔끔한 절벽으로 나타나지는 않습니다.

RNA 함량이 적은 정상 세포는 background 가까이에 놓일 수 있습니다. 단순 UMI 임계값은 이런 세포를 버릴 수 있습니다. EmptyDrops는 낮은 count의 방울에서 ambient RNA 분포를 추정하고, 그 분포와 유의하게 다른 barcode를 실제 세포 후보로 찾습니다.

## 2. 한 행에서 세 지표를 함께 본다

| 지표 | 낮을 때 의심 | 높을 때 의심 |
| --- | --- | --- |
| total UMI count | 적은 RNA, 낮은 포획 효율, 손상 세포 | 두 세포가 함께 들어간 doublet, 원래 RNA가 많은 세포 |
| detected genes | 정보가 적은 세포 | doublet 또는 복잡도가 큰 정상 세포 |
| mitochondrial fraction | 단독으로 문제를 뜻하지 않음 | 세포질 RNA가 빠져나간 손상 세포 가능성 |

각 지표의 절대값은 조직(tissue)의 종류와 protocol에 따라 달라집니다. 면역세포와 큰 종양세포에 같은 UMI 상한을 적용하면 큰 정상 세포를 doublet으로 잘못 제거할 수 있습니다.

분포를 샘플별로 그리고, 극단값에 어떤 세포 유형의 특징 유전자(marker)가 있는지 함께 확인합니다. 임계값은 데이터에서 관찰한 분포와 실험 지식을 근거로 정하고 그대로 기록합니다.

## 3. doublet은 두 세포의 합성 행을 만든다

한 방울에 세포 두 개가 들어가면 같은 cell barcode를 공유합니다. 서로 다른 두 세포의 RNA가 한 행에 합쳐져 실제로 존재하지 않는 중간 상태처럼 보일 수 있습니다.

예를 들어 T세포 marker와 상피세포 marker가 한 행에서 동시에 강하면 새로운 세포 종류보다 doublet을 먼저 의심할 수 있습니다. Scrublet 같은 도구는 관측 세포 두 개를 더해 인공 doublet을 만들고, 실제 행이 그 합성 패턴과 얼마나 닮았는지 점수화합니다.

Doublet score도 판정의 보조 근거입니다. 드물지만 실제로 두 계통의 marker를 함께 발현하는 세포 상태가 있을 수 있으므로, score·총 UMI·marker 조합과 세포 집단에서의 위치를 함께 봅니다.

## 4. ambient RNA는 실제 세포 행도 오염시킨다

깨진 세포에서 나온 RNA는 empty droplet뿐 아니라 세포가 든 방울에도 들어갑니다. 특정 세포 종류에서 매우 많이 발현되는 유전자가 여러 세포 집단(cluster)에 낮게 나타난다면 ambient RNA 신호일 수 있습니다.

SoupX 같은 방법은 empty droplet에서 background expression profile을 추정하고, 세포 행에 섞인 양을 계산해 보정합니다. 보정 전후에 marker의 세포 유형 특이성이 어떻게 달라졌는지 확인해야 합니다. 실제로 약하게 발현된 신호까지 자동으로 오염이라고 단정할 수는 없습니다.

## QC는 삭제 기록을 남겨야 한다

재현 가능한 QC 결과에는 최소한 다음 수가 들어갑니다.

```text
raw barcodes
  -> 실제 세포 후보 선택 후 barcodes
  -> low-quality 제외 후 cells
  -> doublet 제외 후 cells
```

각 화살표마다 사용한 도구·버전·지표·임계값과 제외된 수를 기록합니다. 세포를 2차원에 배치하는 **Uniform Manifold Approximation and Projection**(UMAP) 그림만 남기면 희귀 세포가 원래 없었는지 QC에서 사라졌는지 구분할 수 없습니다.

더 자세한 지표 정의와 점검표는 [싱글셀 QC 지표 레퍼런스](/reference/single-cell-qc-metrics/)에서 확인할 수 있습니다.

## 정리

먼저 empty droplet과 cell-associated barcode를 나누고, 그다음 세포별 UMI·gene 수·미토콘드리아 비율과 doublet·ambient RNA를 확인합니다. 모든 조직에 통하는 고정 임계값은 없으며, 샘플별 분포와 생물학적 차이를 함께 봐야 합니다.

다음 [비슷한 세포를 군집으로 묶기](/lessons/single-cell-clustering/)에서는 QC된 희소 행렬을 정규화하고 이웃 그래프를 만들어 반복되는 발현 패턴을 찾습니다.

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### 출처

- empty droplet과 ambient profile 기반 cell calling: [Lun et al., *Genome Biology* (2019)](https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6431044/)
- ambient RNA 보정 SoupX: [Young & Behjati, *GigaScience* (2020)](https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7763177/)
- doublet 탐지 Scrublet: [Wolock et al., *Cell Systems* (2019)](https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6625319/)
- 단일세포 분석 전반의 QC 모범 사례: [Heumos et al., *Nature Reviews Genetics* (2023)](https://www.nature.com/articles/s41576-023-00586-w)