# 08. 조건별 세포 구성과 발현 비교하기

> 싱글셀 데이터에서 세포 유형의 구성 변화와 같은 세포 유형 안의 발현 변화를 분리하고, 세포를 독립된 사람이나 샘플별로 합쳐 조건 효과를 검정하는 방법.

싱글셀 조건 비교에는 서로 다른 두 질문이 있습니다. **어떤 세포가 늘거나 줄었는가**와 **같은 세포 종류 안에서 어떤 유전자가 달라졌는가**입니다. 한 질문의 결과로 다른 질문에 답할 수 없습니다.

여기서 **donor**는 세포를 제공한 독립적인 사람이나 생물학적 개체입니다. 한 donor에서 세포가 수천 개 나와도 조건을 독립적으로 경험한 개체는 한 명입니다.

> **이 수업의 질문**: 세포가 수천 개여도 환자 수를 표본 수로 유지하며 조건 효과를 어떻게 비교하는가?

## 구성과 상태를 먼저 나눈다

치료 전후 종양에서 T세포 신호가 커졌다면 적어도 두 장면이 가능합니다.

| 질문 | 변화한 것 | 필요한 요약 |
| --- | --- | --- |
| 구성 차이(differential abundance) | T세포의 상대적 수나 포획 비율 | sample × cell type의 cell 수·비율 |
| 발현·상태 차이(differential expression/state) | T세포 안의 유전자 발현 | cell type별 gene × sample count |

T세포가 많아지면 조직(tissue) 전체에서 T세포를 특징짓는 유전자도 올라갑니다. 한 세포 집단에서 상대적으로 높거나 낮아 그 집단을 식별하는 데 쓰는 유전자를 **marker gene**이라고 합니다. 그러나 이것만으로 각 T세포가 marker를 더 강하게 발현했다고 말할 수는 없습니다. 구성 변화와 세포 내부 상태 변화를 분리해 계산해야 합니다.

## 실험 단위는 세포가 아니라 donor다

대조군 환자 3명과 치료군 환자 3명에서 각각 세포 5,000개를 얻었다고 가정합시다. 세포 행은 30,000개지만 치료를 독립적으로 받은 실험 단위는 환자 6명입니다.

같은 환자에서 나온 세포는 유전적 배경, 채취 시점과 같은 실험 처리 묶음(batch)을 공유합니다. 이들을 독립 표본 5,000개로 취급하면 환자 사이 변동을 무시하고 표본 수를 과장하게 됩니다.

```text
잘못된 n: 30,000 cells
조건 효과를 검정할 n: 6 donors
```

세포를 더 많이 포획하면 한 환자의 세포 상태를 더 자세히 볼 수 있지만 환자 수가 늘지는 않습니다.

## 세포 count를 donor별로 합친다

세포별 count를 같은 donor와 cell type 안에서 유전자별로 합친 표를 **pseudobulk**라고 합니다. T세포의 조건별 발현을 비교하려면 각 donor의 T세포에서 변환 전 원래 값인 raw count를 유전자별로 합칩니다.

```python
pseudobulk[donor, gene] = sum(
    raw_count[cell, gene]
    for cell in cells
    if cell.donor == donor and cell.cell_type == "T cell"
)
```

이 코드는 개념을 옮긴 의사코드입니다. 결과는 익숙한 `gene × donor` raw count matrix가 됩니다. 이 표에 DESeq2·edgeR·limma처럼 반복 샘플 사이의 변동을 모델링하는 방법과 적절한 design을 적용할 수 있습니다.

| gene | control_1 | control_2 | control_3 | treated_1 | treated_2 | treated_3 |
| --- | ---: | ---: | ---: | ---: | ---: | ---: |
| IFNG | 142 | 119 | 155 | 380 | 290 | 412 |
| CCL5 | 811 | 760 | 902 | 990 | 870 | 1104 |

여기서 한 열은 donor 한 명의 T세포 묶음입니다. [여러 샘플의 차등발현 검정](/lessons/bulk-rna-deg/)에서 배운 반복과 음이항 모델을 세포 유형별로 다시 사용할 수 있습니다.

실제 bulk paired design에서 환자 ID와 Tumor·Normal 열을 맞추고 DESeq2를 실행하는 과정은 [GSE251845 차등발현 실습](/practice/colorectal-deg-gse251845/#3-1-raw-count와-환자-짝-확인)에서 볼 수 있습니다. 싱글셀 pseudobulk에서도 이 샘플 단위 조인이 그대로 중요합니다.

## marker 탐색과 조건 비교는 다른 검정이다

군집 marker는 군집 이름을 붙이기 위해 해당 군집과 나머지 세포를 비교합니다. 조건 비교는 같은 cell type 안에서 대조군 donor와 치료군 donor를 비교합니다.

| 분석 | 비교 단위 | 답하는 질문 |
| --- | --- | --- |
| cluster marker | cluster vs other clusters | 이 군집을 구분하는 유전자는 무엇인가? |
| pseudobulk 발현 비교 | donors in condition A vs B | 이 세포 종류가 조건에 따라 어떻게 변했는가? |

여러 샘플의 기술적 차이를 줄인 통합 좌표에서 군집을 찾았더라도 발현 비교에는 raw count와 실제 donor·condition metadata를 사용합니다. 세포를 2차원에 배치하는 **Uniform Manifold Approximation and Projection**(UMAP) 좌표를 발현 count처럼 검사하지 않습니다.

## 세포 비율도 donor별 값을 비교한다

구성 변화는 donor마다 다음 표를 먼저 만듭니다.

| donor | condition | T cell | B cell | myeloid | stromal |
| --- | --- | ---: | ---: | ---: | ---: |
| C1 | control | 0.18 | 0.07 | 0.54 | 0.21 |
| C2 | control | 0.23 | 0.05 | 0.49 | 0.23 |
| T1 | treated | 0.61 | 0.08 | 0.21 | 0.10 |
| T2 | treated | 0.55 | 0.06 | 0.25 | 0.14 |

세포 비율은 합이 1인 조성 데이터이고, 포획·조직 분리 편향도 받습니다. 세포를 한데 합친 전체 비율만 비교하지 않고 donor별 분포와 세포 수를 함께 보여 줍니다. 표본 수가 작다면 큰 차이가 보여도 모집단 효과를 정밀하게 추정하기 어렵습니다.

## 설계 단계에서 condition과 batch를 분리한다

모든 대조군을 월요일에 처리하고 모든 치료군을 화요일에 처리하면 날짜 효과와 치료 효과가 완전히 겹칩니다. 분석 도구가 둘을 분리할 정보가 없습니다.

가능하면 각 batch에 여러 condition을 섞고, donor와 sample ID를 세포별 정보표인 metadata에 보존합니다. 분석 시에는 다음을 기록합니다.

- 독립 donor 수와 donor별 포획 cell 수
- paired 여부와 condition
- library preparation·sequencing batch
- cell type별 pseudobulk에 포함된 최소 cell 수
- 사용한 raw count layer와 통계 design

## 정리

구성 변화는 donor별 cell type 비율로, 발현 변화는 같은 cell type의 raw count를 donor별로 합친 pseudobulk로 비교합니다. 수천 세포를 독립 반복으로 세지 않고 실제 donor 변동을 보존해야 조건 효과를 과장하지 않습니다.

이것으로 기본 싱글셀 RNA-seq 흐름은 `세포별 측정 → 세포·분자 주소 → count matrix → 품질 관리 → 군집 → 주석 → 샘플별 비교`까지 연결됩니다. 파일과 객체 구조를 다시 찾을 때는 [싱글셀 데이터 구조 레퍼런스](/reference/single-cell-data-structures/)를 사용하세요.

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### 출처

- single-cell DEG에서 biological replicate의 중요성: [Squair et al., *Nature Communications* (2021)](https://www.nature.com/articles/s41467-021-25960-2)
- 단일세포 조건 비교 모범 사례: [Heumos et al., *Nature Reviews Genetics* (2023)](https://www.nature.com/articles/s41576-023-00586-w)